دانلود فایل ورد مقاله روشهاي بيوشيمي مطالعة سلول

    —         —    

ارتباط با ما     —     لیست پایان‌نامه‌ها

... دانلود ...

بخشی از متن دانلود فایل ورد مقاله روشهاي بيوشيمي مطالعة سلول :

روشهای بیوشیمی مطالعه سلول

سیتوشیمی
با كمك روشهای سیتوشیمی می‌توان ساختمانهای شیمیایی اجزاء سلول را در وضعیت طبیعی ( In Situ ) آن شناخت دو راه را برای این منظور وجود دارد :
1) استفاده از مواد شیمیایی كه در اثر تماس با مواد دیگر درون سلول واكنشی ظاهر سازند كه به كمك میكروسكوپ الكترونی قابل رؤیت است .
برای مطالعه با میكروسكوپ نوری بایستی این مواد شیمیایی رنگی باشند و برای مشاهده در میكروسكوپ الكترونی باید این مواد مانع حركت الكترونها، یا باعث پراكندگی آنها گردند. (1)

2 ) امكان دوم استفاده از آنزیم‌هایی است كه بطور اختصاصی موادی را تجزیه نمایند این مواد بعداً در سلول قابل رؤیت نیستند تعیین اینكه محصول یك واكنش جزئی از ساختمان سلول است یا خیر زمانی ممكن است كه نتیجه واكنش سبب انباشتگی و تراكم ماده مورد جستجو گردد علاوه بر این واكنش باید طوری اختصاصی باشد كه قضاوت قابل اعتمادی را ممكن سازد از طرف دیگر اجزاء سلولی به قدر كفایت طبیعی باقی بمانند تا مقایسه و قضاوت را ممكن سازند (مثلاً تراكم موادی در میتوكندری زمانی قابل اثبات است كه ساختمان میتوكندری به شكل طبیعی آن موجود باشد با دو مثال مطالب فوق روشن می‌گردد :

در نقاط مختلف سلول فسفاتاز یعنی آنزیمی كه هیدر

ولیز فسفات را تسریع می‌نماید وجود دارد اگر یك سلول ثابت شده با آلدئید را (آلدئید فعالیت آنزیمی را از بین نمی‌برد) با مخلوطی از فسفات محلول و نیترات سرب مجاور كنیم (قطره‌ای روی بافت قرار می‌گیرد) در نقاطی كه آنزیم موجود است فسفات هیدرولیز شده و تولید اسید فسفریك می‌نماید كه خود در اثر تركیب با نیترات سرب فسفات سرب به وجود می‌آورد .
این تركیب غیر قابل حل در آب بوده و تولید رسوبی می‌نماید كه به شدت الكترونها را متفرق می‌كند به این ترتیب تمام نقاطی كه دارای فسفاتاز هستند در سلول مشخص می‌گردند .

دیواره غالب سلولهای گیاهی دارای سلولز می‌باشد كه با املاح فلزات سنگین كنتر است ندارد اگر آنزیم سلولاز را روی سلول ثابت شده با آلدئید اثر دهیم سلولز به موادی كه ملكولهای ریز قابل حل در آب تبدیل می‌گردند این عمل منجر به از بین رفتن كنتر است تقاطعی كه قبلاً سلولز وجود داشت می‌گردد با این روش می‌توان پی به مقدار كمی سلولز در دیواره سلولزی و احتمالاً چگونگی سنتز آن پی برد . (2)

اتورادیوگرافی ( AUTORADIOGRDHY ) :
ایزوتوپهای رادیواكتیو ایزوتوپهایی هستند كه هسته آنها در اثر تشعشع پیوسته تحلیل می‌رود این گونه ایزوتوپها در سیتولوژی برای ردیابی مواد معینی در سلول به كار گرفته می‌شود با كمك منوساكاریدهای علامت‌گذاری شده با14 Cمی‌توان بوسیله روشهای اتورادیوگرافی یا به طور مستقیم توسط اندازه‌گیری فعالیت تشعشعی اجزاء مختلف سلول سنتز پلی‌ساكاریدها را مشخص كرد روش اخیر با كمك دستگاه مخصوصی به نام سین‌سیلاسیون شمار (نور ساطع كردن و برق زدن = Scintilation ) انجام می‌گیرد .

در روش مستقیم اتورادیوگرافی می‌توان از میكروسكوپ نوری یا الكترونی استفاده كرد در هر دو مورد بافت بعد از دریافت ماده رادیو اكتیو ( خوراندن ـ تزریق ) ثابت آغشته و برش داده می‌شود مقاطع بعداً با لایه‌ای حساس یا فیلم پوشانده می‌شوند تشعشعات ماده رادیو اكتیو مثل اشعه نور صفحه فیلم یا ماده حساس دیگر را متأثر و فیلم پس از ظهور در محل سیاه شده مورد مطالعه قرار می‌گیرند شرط موفقیت دراتورادیوگرافی انتخاب ماده حساس برای پوشاندن مقاطع انتخاب زمان دقیق برای تأثیر اشعه و بالاخره ظاهر كردن مناسب ماده حساس یا فیلم می‌باشد معذالك نمی‌توان از این روش در هر موردی از سیتولوژی استفاده نمود اتورادیوگرافی بیش از هر روش دیگر به دقت و تجربه نیازمند است . (2)

جداسازی اجزاء سلول :
برای انجام آزمایشات شیمی با اندازه‌گیری و مطالعه عمل اجزاء مختلفه یك سلول : لازم است كه این اجزاء از بقیه قسمتها جدا گردند برای این منظور سلولها هموژن می‌شوند بعد محتویات سلولها با كمك اولترا سانتریفوژ به صورت بخشهای مستقلی كه هر یك محتوی ساختمان خاصی از سلول هستند از هم جدا می‌گردند .
عمل هموژن كردن در سلولهائی كه با دیواره سختی پوشیده نمی‌شوند از طریق شوك اسمزی با تأثیر امواج صوتی بالای Hkz 20 صورت می‌گیرد .

سلولهای بادیواره سخت بایستی در هموژنیزاتور با چاقو یا گلوله‌های شیشه‌ای ذرات كوارتز و نظایر آن ساییده شوند در هر حال این عمل نباید موجب آسیب و در نتیجه كاهش فعالیت اجزاء سلولهای گردد عمل سانتریفوژ كردن در دو مرحله انجام می‌گیرد :
1 ) نوع ساده DiFFERENCIAL CENTIFU GATION
2 )‌جدا كردن به طریق هموژنی ( ISOPICNIC )
كروماتوگرافی ( CHROMATOGRAPHY ) :

با كمك روشهای كروماتوگرافی ملكولهای مختلف بر اساس ویژگیهای متفاوت خود نظیر ملكول‌ها ( فیلترژله‌ای ) حلالیت در دو فاز ( كروماتوگرافی تقسیمی ) و بالاخره خصوصیات جذبی ( كروماتوگرافی جذبی ) از یكدیگر جدا می‌گردند . (3)
الكتروفورز ( ELECTROPHORESIS ) :
ملكولهای دارای بارالكتریكی نظیر اسیدهای آمینه و پروتئینها در یك میدان الكتریكی توجه به نقطه ایزوالكتریك خود با سرعتهای متفاوت مهاجرت می‌نماید این كیفیت را الكتروفورز می‌گویند پس در این روش ملكولهای دارای بار الكتریكی بر حسب سرعت خود مشخص از یكدیگر جدا می‌گردند عمل الكتروفورز می‌تواند در یك محلول بافر انجام می‌گیرد غالباً برای محلول بافر كه نقش الكترولیت را دارند ناقل سختی نظیر كاغذ لایه‌های نازك استات یازل پلی‌آكریل آمید ( Polyacrylamidgl ) انتخاب می‌گردد در اینجا ملكولها نه تنها به علت بار الكتریكی متفاوتشان بلكه بر حسب اندازه و شكل ملكول‌هایشان جدا می‌گردند هرچه وزن ملكولی بیشتر باشد حركت ملكول كندتر است ساختمان فضائی ملكولها نیز در حركتشان مؤثر است .
اساس كار به قرار زیر است :
ژل جدا كننده با ژل یك ثانویه باروزنه‌های درشت پوشیده می‌‌شود كه روی آن محلول مورد آزمایش منتقل می‌گردد در میدان الكتریكی ملكولها در ژل ثانویه مهاجرت می‌نمایند و در مرز بین دو ژل در یك بخش نازك متمركز می‌شوند در اینجا ملكولها در ژل جدا كننده ( اولیه ) بر طبق اندازه ملكولها و تحرك الكتروفورزی خود جدا می‌گردند بین ژل جدا كننده ( اولیه ) و ژل جمع كننده ( ثانویه )، دو عامل غیر هماهنگ PH و اندازه روزنه‌ها در دو ژل موجود می باشند . (3)
فتومتری ( PHOTOMETRIE ) :
عده‌ای از اجزاء سلولی این خاصیت را دارند كه امواج نوری با طول موجهای معین را جذب نمایند و با این كیفیت می‌توان این اجزاء را از نظر كیفی و كمی مورد مطالعه قرار داد . (3)

متد كشت سلول :
تكنیك كشت سلول یا بافت در بیوشیمی بیولوژی ملكولی فیزیولوژی سلولی ژنتیك، جنین شناسی، انگل شناسی، بافت شناسی و غیره به كار می‌رود معمولی‌ترین سلولهایی كه كشت داده می‌شوند سلولهای باكتریها و سلولهای بافتهای پستانداران هستند برای كشت سلول باید اول محیط كشت مناسب آن نوع سلول خاص تهیه گردد كه در آن عوامل منبع انرژی سلولها، امواج، عوامل رشد، اسیدیته ( PH ) مناسب و حرارت مورد توجه قرار می‌گیرند .

محیط كشت سلولهای پستانداران پیچیده‌تر از محیط كشت مورد نیاز سلولهائی نظیر باكتریهاست در ابتدای كار كشت سلول این‌طور معمول بود كه مخلوطی از سرم و عصاره جنین جوجه، به عنوان محیط كشت بكار برده می‌شدند در سلولهای اخیر محیط كشت تركیبی درست شده كه محتوی تركیبات متعددی است بعنوان مثال می‌توان محیط كشت تركیبی از آب، املاح و مواد معدنی و محتوی متابولیتهای زیادی باشد حتی امروزه علیرغم تركیبات پیچیده محیطهای كشت تركیبی ب

ه طور معمول لازم است كه از سرم جنین یا سرم اسب و غیره بعنوان تكمیل كننده محیط كشت كه باعث رشد سلول شود استفاده نمایند ساده‌ترین تكنیك برای مطالعه رشد سلولهای پرندگان و پستانداران متد برداشت بافت است قطعه كوچكی از بافت را روی لاملی كه با قطره‌ای از پلاسمای جوجه و محیط كشت پوشیده است قرار می‌دهند پلاسما سخت شده و منعقد می‌گردد لامل بر روی یك لام گرد برگدانده می‌شود به طوریكه بافت و پلاسما در سطح زیرین قرار گیرند اطراف لامل توسط پارافین مذاب با قلم‌مو كاملاً مسدود و كشت در محیط با حرارت مناسب نگهداری می‌شود

.
كلیه عملیات كشت سلول از قبیل تهیه محیط كشت و وسائل جراحی و محل نگهداری بافت باید استریل شوند علاوه بر روش فوق روشهای دیگری از كشت بافت و سلول وجود دارند كه طی آن سلولها را می‌توان در بطری و یا در ظرف پتری و غیره بر حسب نوع تجزیه كشت داد . (4)

طرز قرار گرفتن بافت و محیط كشت با استفاد ه از لام مخصوص
بیولوژی سلولی و بیولوژی ملكولی

فصل دوم :

«میكرو مور فولوژی سلول »

در این قسمت به مطالعه ساختمان كلی و میكروسكوپی یاخته‌های تغییر نیافته می‌پردازیم مطالعه ساختمان شكلهای تغییر یافته سلول بعداً مورد بحث قرار می‌گیرد .
بخش اول مربوط به سلول جنینی ( مریستمی ) بعد سلول جانوری تغییر یافته واختصاصات آن وبالاخره ساختمان باكتریها و سیانو فسیه‌ها یعنی نمونه‌های پروكاریوت مطالعه خواهند ( Prokaryotes ) البته باید توجه داشت كه این گروه از سلولها مثل یوكاریوتها ( Eucytes ) شامل بخش شبه هسته یا به اصطلاح نوكلئوتید (Nucleoid ) پلاسما و دیواره می‌باشند .

در سلولهای گیاهی دیواره سلولی گاه‌گاه بوسیله كانالهائی كه همان پلاسمودسماستا ( Plasmodesmata ) هستند قطع می‌گردد در داخل غشاء سیتو پلاسم و در مركز آن هسته قرار گرفته كه در آن كروماتین و هستك ( نوكلئوس ) جای دارند هسته با شبكه تور مانندی از جنس غشاء كه در تمام سلول كشیده شده و آندوپلاسمیك رتیكولوم ( Endoplasmic Reticum ) خوانده می‌شود احاطه می‌گردد .
این غشاء‌ها بعد از برش به شكل دو خط باریك در سلول جلب توجه می‌كنند علاوه بر اینها

ارگانلهای دیگر مانند میتوكندریها، پلاستیدها، سیتوزومها، دیكتیوزومها ( مجموع آنها دستگاه گلژی را می‌سازند ) ریبوزومها ( قسمتی از ER دانه‌دار ) واكوئلها و بالاخره اجزاء ذخیره‌ای نظیر كریستال پروتئین قطرات چربی در آن دیده می‌شوند دیكیتوزومها، ریبوزومها و شبكه آندوپلاسمی درون هیالوپلاسم ( بخش پلاسمای فاقد اندامك ) قرار دارند .
به استثنای پلاستیدها كه در گیاهان سبز به وجود می‌آیند بقیه اجزاء درون سلول در قارچها و در سلولهای جانوری ( البته با تفاوتهائی ) هم وجود دارند واكوئلهای بزرگی كه در سلولهای گیاهی وجود دارند پلاسمودسمها و تغییرات دیواره سلولزی از اختصاصات سلولهای گیاهی می‌باشند برعكس سانتریولها در سلولهای گیاهان عالی دیده نمی‌شوند ولی در تمام سلولهای جانوری همچنین در پروتوفیت‌های(Protophytes) دنیای گیاهان وجود دارند و در ساختن دوكها و سیستم حركت مژه و تاژك ظاهر می‌گردند .(3)
ساختمان ظریف سلول یوكاریوت
غشاء سیتوپلاسمی ( Unit Membrane ) :
سلول زنده خودش را در مقابل محیط به وسیله غشایی محافظت نموده و قادر است با كمك آن تركیب محیط داخلی خویش را برای اعمال متابولیسمی مساعد نموده و این تركیب را نیز حفظ نماید .
این غشاء با ضخامتی در حدود 5 تا 10 نانومتر در میكروسكوپ الكترونی سه لایه‌ای به نظر می‌رسد و با كیفیت ذكر شده سبب می‌گردد كه مثلاً غلظت پتاسیم درون سلول در مقایسه با سطح خارجی غشاء اختلافی برابر 103 نشان دهد در حالیكه برخی از مواد جز به مقدار ناچیز در سلول وارد نمی‌گردند حتی اگر به مقدار فراوان در اختیار سلول قرار گیرند

.
بنابر این وظیفه غشاء سلولی كنترل تبادل آزاد مواد و همچنین عضوی از انتقال مواد است كه با كمك آن موادی حتی در جهت عكس كیفیت انتشار وارد سیتوپلاسم و یا از پلاسما به طرف خارج سلول منتقل می‌گردند .
به همین جهت ساختمان شیمیائی و آنزیمی و نحوه عمل آن برای تحقیقات تراوائی و انتقال اهمیت بسزائی دارد .
غشاء بیولوژیكی در مقابل انتشار مواد لیپوفیل مقاومتی

نشان نمی‌دهد حتی ملكولهای درشت از این دسته مواد می‌توانند به راحتی از آن بگذرند در حالیكه عبور ملكولهای هیدروفیل بستگی به اندازه آنها دارد .
هرچه ملكول هیدروفیل كوچكتر باشد عبور آن راحت‌تر انجام می‌گیرد ( تأثیر اوالترافیلتری غشاء ) مثال شناخته شده‌ای كه ویژگیهای متفاوت غشاء‌های بیولوژیكی را در رابطه با قابلیت تروائی غشاهای زیستی نشان می‌دهد تله‌یونهای قرمز خنثی است قرمز خنثی ملكولهای لیپوفیل درشتی دارد كه از غشاء بدون مانع می‌گذرند و وارد واكوئل می‌گردند در محتوی اسیدی واكوئل ملكولهای قرمز خنثی یونیزه شده و تولید یونهای هیدروفیل می‌نمایند كه نمی‌توانند از غشاء عبور كنند یعنی از واكوئل نمی‌توانند مجدداً خارج گردند و با ورود بیشتر قرمز خنثی به واكوئل و تجزیه آن مقدارش در واكوئل پیوسته افزایش می‌یابد خصوصیات دینامیك غشاء سلول كه پیوسته در حال ترمیم است با ساختمان متغیرغشاء واكنشهای انتقال مواد از غشاء سلولی قابل تطبیق است. (4)
در كنار پلاسمای زمینه ( Hyaloplasma ) این ساختمان مهمترین بخش هر سلول است غشاء تمام پروتوپلاسما را به فضاهائی تقسیم می‌نمایند كه در آنها واكنش‌های مختلف در حال انجام هستند مثل هسته، پلاستید‌ها میتوكندریها، دیكتیوزومها، لیزوزمها و غیره . تمام این اجزاء بوسیله غشائی از جنس و ساختمان مشتركی شبیه غشاء سلول احاطه می‌گردند . ( Unit Membrane ) و همین كیفیت انجام واكنشهای كاملاً متضادی را درون سلول در كنار همدیگر ممكن می‌سازد علاوه بر اینها تعداد زیادی آنزیم پیوسته به غشاء فعالیت كنند كه اساس ساختمانی عده زیادی از واكنشهای بیوشیمیائی را به وجود می‌آورند غشاهای بیولوژیكی با این خصوصیات قابل مقایسه با غشا‌های مصنوعی كه غالباً برای مطالعه مكانیسم انتقال و كیفیت تراوائی غشاء مورد آزمایش قرار می‌گیرند نیستند این غشاء با میكروسكوپ نوری قابل رؤیت نیست با وجود این، وجود آنها مدتها قبل از اختراع میكروسكوپ الكترونی مسلم بوده است .
با متدهای غیر مستقیم توانسته‌اند به ساختمان تقریباً دقیق غشاء پی ببرند اواخر قرن گذشته بعد از آزمایشهای فراوان روی تراوائی غشاء‌ها به این نتیجه رسیدند كه بخش اعظم غشاء‌های بیولوژیكی باسیت از لیپید درست شده باشد چون كه مواد محلول در چربی به مراتب بهتر از غش

اء می‌گذرند تا مواد محلول در آب. ملكولهای چربیهای ساختمانی قابلیت تجمع و ایجاد ساختمانهای صفحه مانند را دارند از بین چربیهای ساختمانی فسفولیپیدها و گیلیكولیپیدها از اهمیت بیشتری برخوردارند این ملكولها از گلیسرین اسیدهای چرب و اسید فسفریك در گیلیكولیپیدهد قند به وجود آمده‌اند از سه گروه OH مربوط به گلیسرین در فسفولیپید دو گروه OH با اسیدهای چرب و سومی

با اسید فسفریك پیوند می‌خورد كه آخری بخش قطبی ملكول(آب دوست ـ Hydrophyle) را می‌سازد در حالیكه زنجیرهای هیدروكربور اسیدهای چرب، بخش غیر قطبی ( Hydrophobe ) آن را تشكیل می‌دهند و به این ترتیب از چربیهای ذخیره‌ای كه تجمع توده‌ مانندی به وجود می‌آورند ( Plasmoqlobuli = قطرات چربی = Oleusome ) مشخص می‌گردند و در نتیجه این كیفیت سطح فعال به وجود آمده توسط چربیهای ساختمانی زیاد و در نزد چربیهای ذخیره‌ای غیر قطبی اندك خواهد بود .

لینک کمکی